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通过16S rDNA测序鉴定钛种植体表面上的口腔细菌
Identification of oral bacteria on titanium implant surfaces by 16S rDNA sequencing
Clin Oral Implants Res. 2017 Jun;28(6):697-703.
doi: 10.1111/clr.12865
背景
商业上，纯钛（cpTi）和Ti-6Al-4V合金主要用于牙科和整形外科植入物，并且由于其良好的生物相容性，与适当的机械性能，已成为牙齿置换的成功选择。然而，植入晚期失败仍然会发生，最近的研究表明，20％的种植体周围会发生炎症，这与种植体表面的细菌生物膜形成密切相关。简而言之，植入物插入后，水分子以及含有蛋白质的液体如唾液，龈沟液和血清等结合到植入物表面并结合离子形成富含蛋白质的薄膜并最终形成生物膜，微生物附着在生物膜上，增加了种植体周围组织炎症产生的可能性并使得支撑骨逐渐破坏。
鉴定特定表面相关的口腔微生物群对于理解植入物的初始细菌定植和疾病的潜在发展是必不可少的。众所周知，一些牙周病相关细菌早在牙种植体植入后30分钟就被发现存在于表面。目前，基于16S rDNA测序技术已被用于鉴定口腔环境中的潜在病原体，并且该策略具有检测潜在细菌群落的完整基因组的优势。
主要材料：
将8个正常加工的钛盘和8个表面粗糙处理的钛盘(SLA)安装在4名患者的可移除的口内夹板上。 在口内暴露24小时后，从钛盘和上下龈下牙齿区域收集生物膜样品。对每个样品的16S rDNA基因进行扩增并用Miseq Illumina仪器测序。
主要分析流程：
OTU聚类：
通过DNACLUST 3对序列进行聚类，去除其中丰度低于3的分类，并以UCHIME denovo和UCHIME作为参考鉴定其中的嵌合体，最终完成OTU的聚类分析。
OTU物种分类：
OTU通过核糖体数据库项目（RDP）的分类工具以及其中的数据集进行OTU的物种分类鉴定。
OUT 进化分析
OUT 通过PyNAST比对到Greengenes core数据集上，并提取联配结果其中变异度较高的联配结果，并通过FastTree进行进化树的构建。
OUT多样性指数等分析
使用QIIME软件包计算α（观察到的物种）和β（）多样性指数，分类学分类，UPGMA聚类和OTU热图。
主要结果：
1、测序数据概况
分析中共用到663, 943条序列，所有的序列控制到固定长度165bp并按照3%的遗传距离聚类到共541个OTU中，正常加工的和SLA两组数据有相似数量的OTU结果，如图1所示。
图1 不同处理的OTU聚类结果。
OTU多样性以及物种情况
总体来看，OTU可以划分到36个更高等级的分类中，包括29个属和7个更大的分类（比如科，目、纲等），代表的有Firmicutes, Proteobacteria, Fusobacteria, Bacteroidetes, Actinobacteria, Synergistetes 和TM7 七个门 ，其中Firmicutes占所有序列的48.4％。在这些分类中，两种处理的OTU数量没有出现明显的不同，同样在整体中数量也类似（图2）。其中Synergistetes 这个分类仅在SLA有发现。
图2 OTU鉴定结果的主要分类的丰度分布图。
在牙齿，SLA和正常加工钛盘表面鉴定出的细菌分类数量分别是36，27和26。三种不同处理中的细菌分类比例在图三中可以观察到，其中比例低于1%的分类没有被包括。
图3 三种不同处理鉴定出的OTU的细菌分类比例圆饼图。
在正常机器处理钛盘和牙齿表面鉴定的细菌属基本均能在SLA表面找到，如图4a所示。属Kingella, Anaeroglobus, Tannerella and TG5在SLA表面能够找到，但不能在正常机器处理钛盘表面找到，而属Selenomonas和Eikenella在正常机器处理钛盘表面能够找到而不能在SLA表面找到。结合图4a和b来看，属Jhonsonella, Dialister, Corynebacterium, Cardiobac- terium 和目EW055仅在牙齿表面发现。
图4 三种不同处理按照属分类
图5代表的是所有鉴定出的OTU所构建的进化树，不同颜色代表不同的门。
图5 三种不同处理鉴定出的所有OTU所构建的进化树。
Chao1指数和Shannon 多态性两个说明微生物物种丰度的结果均指向SLA处理的表面样本均比正常机器处理的表面样本丰度高，而牙齿表面的微生物丰度高于SLA处理和正常机器处理表面的丰度。
图6 三种不同处理表面微生物丰度分布图。
