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标准化分析 > RNA测序 > smallRNA测序 > smallRNA案例
来自寄生植物菟丝子（Cuscuta campestris）的miRNA靶向宿主的mRNA
MicroRNAs from the parasitic plant Cuscuta campestris target host messenger RNAs
Nature (2018)553: 82–85
doi:10.1038/nature25027
背景
在宿主引起的基因沉默（host-induced gene silencing，HIGS）机制中，siRNA产生的基因沉默靶向病原体和寄生物的mRNA。植物中的HIGS对于真菌、线虫、昆虫和寄生植物菟丝子十分有效。HIGS机制表明植物与寄生物之间存在自然的小RNA交换。与这个假设一致的是，来自植物病原菌灰霉菌（Botrytis cinerea）的小RNA在侵染的过程中靶向宿主mRNA，并且为了减少病原体的毒力HIGS靶向灰霉菌中的dicer-like的mRNA。相反地，棉花中的miRNA可以进入到真菌病原体（Verticillium dahliae）中。然而，植物与植物之间的miRNA的自然交流还没有报导。
菟丝子（Cuscuta campestris）的吸器能够便于病毒、蛋白和mRNA的双向移动，但是这些移动的具体功能还未知。菟丝子易受HIGS的影响，因此假设通过菟丝子的吸器小RNA可以与受体物种间进行交换，并且影响受体物种的基因表达。
主要材料方法
1. 材料与数据
利用寄生在拟南芥上的菟丝子进行小RNA高通量测序，共收集三种不同类型的组织，每种组织有两个生物学重复。三种不同类型的组织分别如下：寄生茎，包括菟丝子吸器上不的茎；交界面，包括菟丝子的吸器和茎，以及拟南芥的茎；宿主茎，包括拟南芥在交界面上部的茎。
小RNA数据已上传到NCBI GEO, 编号为GSE84955， 项目编号为PRJNA408115.
2. 主要分析流程
生物信息学分析：所有数据都在拟南芥和菟丝子中鉴定小RNA，并且进行差异表达分析, 鉴定和分析涉及的主要软件有targetfinder.pl 和GSTAr.pl (小RNA靶向预测)、shortStack（小RNA测序分析）、strucVis（小RNA二级结构可视化）。
主要结果
1、菟丝子miRNA在吸器与拟南芥的交界面被诱导产生
与寄生茎相比，交界处的寄生物的RNA与宿主的RNA相互稀释，因此菟丝子小RNA位点的表达量在交界处都下调（图1a）。然而，有76种菟丝子小RNA在交界处显著上调（FDR≤0.05），其中43种（57％）miRNA在前体的发夹结构中具有离散的miRNA对中出现积累（图1b）。同时来自RNA印迹的证据说明特定miRNA在交界面的特异性表达（图1c）。 43种miRNA其中的一种是保守MIR164的一员， 其他42种上调的miRNA和已知miRNA序列相似性很低。在发芽四天并和寄主互作菟丝子材料中，通过PCR检测到了了几个miRNA。
图1 菟丝子miRNA在吸器与拟南芥的交界面被诱导产生
2、菟丝子miRNA引起基因沉默和宿主mRNA产生siRNA
大多数菟丝子诱导的miRNA产生了22nt的成熟miRNA。这种22nt的miRNA在植物中发生频率低于21个nt的miRNA，并且与次级siRNA密切相关,而次级siRNA被认为会扩大miRNA指向基因沉默。假设诱导产生的22nt的miRNA会导致形成次级siRNA。因此，在拟南芥miRNA测序数据中进行搜索包含miRNA互补位点并具有在界面处特异性积累siRNA的序列，共发现六个拟南芥mRNA符合：TIR1，AFB2和AFB3，编码生长素受体，BIK1，编码一种质膜定位所需的激酶， SEOR1，编码韧皮部蛋白和HSFB4，它编码预测的转录抑制因子。由这些mRNA产生的siRNA和其他实例的次级siRNA在大小分布，双链积累和定相中的作用相似（图2a，b）。 其中TIR1，AFB2和AFB3三个mRNA已知被22nt的miR393所靶向并在下游产生二级siRNA。而在寄生茎中，TIR1，AFB2和AFB3三个mRNA所产生的次级siRNA向上游移位，靠近和菟丝子miRNA互补的位点，暗示菟丝子产生的miRNA和miR393不相关，并触发了和宿主交互界面的次级siRNA。对未加帽的mRNA片段的分析显示在与菟丝子miRNA互补的所有位点均有定向切割的现象，特别是来自交互界面的样品，同时在对照样品中的miRNA没有这个现象（图2）。
图2 菟丝子miRNA引起基因沉默和宿主mRNA产生siRNA。
3、菟丝子miRNA和它们的靶基因的效应
在拟南芥转录数据中，没有找到任何靶向这六个拟南芥mRNA的拟南芥miRNA或siRNAs，也没有发现任何内源性菟丝子次级siRNA对应于任何诱导产生的miRNA。这些观察结果表明诱导产生的菟丝子miRNA避免靶向自身转录本，来自菟丝子的22nt的miRNA通过跨物种方式靶向拟南芥mRNA。这六个拟南芥mRNA中的五个相对于一般茎在寄生交界的茎中出现了显著的表达降低（图3a，蓝色为对照样本）。拟南芥中的次级siRNA的表达量积累部分依赖于内源基因DCL4同时完全依赖于RDR6(SGS2)。TIR1基因的次级siRNA表达量在sgs2-1突变体中表达量完全消失而在dcl4-2t中下降（图3b），因此DCL4和RDR6对于次级siRNA十分作用,说明菟丝子诱导的miRNA在宿主细胞中活跃并激发了宿主中的沉默机制从而产生次级siRNA。在scz2, tir1-1/afb2-3等突变体作为宿主时，并未观察到明显菟丝子的生物量变化， 而在bik1突变体作为宿主时，菟丝子生物量发现显著下调（P<0.5）(图3c)。但是由于BIK1同时参与到植物发育和免疫中，其发育相关的功能可能会掩盖其在和菟丝子相互作用中发挥的作用。而在seor1 或afb3-4突变体中观察到菟丝子生物量显著升高（P <0.05）（图3c）。 因此，SEOR1和AFB3都有限制菟丝子在拟南芥上的生长。这种观察与此前SEOR1和AFB3跨物种进行miRNA调控的假设一致。
图3 菟丝子miRNA和它们靶基因之间的效应
4、菟丝子miRNA在宿主中的靶基因的保守性
菟丝子在双子叶植物中有广泛的宿主范围。因此，在双子叶植物中进行了同源基因与菟丝子 miRNA互补的mRNA。其中BIK1，SEOR1，TIR1和HSFB4的同源基因被作为候选目标，其中GAPDH仅能靶向一个物种（图4a），所以得出结论BIK1，SEOR1，TIR1和HSFB4这四个基因能够在多个双子叶植物中靶向菟丝子miRNA。同时在本氏烟草中进行了和拟南芥相同的实验和miRNA研究，和菟丝子接触引发的miRNA位点在两个物种间具有高度可重复性。几种在本氏烟草中诱导产生饿菟丝子miRNA也通过RNA印迹实验得到证实（图4b）。通过对未加帽RNA末端的分析，说明了本氏烟草中miRNA对TIR1同源物的切割（图4c，d）。这直接说明了相同的菟丝子 miRNA靶向不同物种中的同源宿主mRNA。同时在死竹子作为宿主进行菟丝子寄生的实验说明活的宿主是菟丝子寄生产生的miRNA表达的必要条件（图4b）。
图4 菟丝子miRNA在宿主中的靶基因的保守性
小结
菟丝子（Cuscuta spp.）是一种专门寄生的植物，它通过吸器从宿主植物的茎中吸收水分和养分。菟丝子的吸器促进了宿主和寄生物之间的病毒、蛋白、mRNA的双向移动，但是这些双向移动的功能效果目前还未知。本次研究揭示了菟丝子（Cuscuta campestris）在寄生到拟南芥上后，其吸器中积累了大量的新的miRNA，并且大多数这种miRNA是22nt。在植物中22nt长的miRNA并不常见，并且可能与次级siRNA（siRNA）产生与靶沉默的扩增相关。在寄生状态，有些22nt的菟丝子miRNA靶向拟南芥的mRNA，从而导致mRNA分裂、二级siRNA产生和mRNA积累量的下降。宿主中编码靶向mRNA的两个位点的突变支持菟丝子显著更高的生长。菟丝子寄生到拟南芥上时表达和活跃的miRNA，也在菟丝子寄生到本氏烟（Nicotiana benthamiana）时表达和活跃。多个其他植物物种中靶mRNA的同源基因也含有能够诱导菟丝子miRNA的预测靶向位点。这些数据揭示菟丝子miRNA能够调节宿主基因的表达，并且表明它们可能在寄生时作为毒力因素。
MicroRNAs from the parasitic plant Cuscuta campestris target host messenger RNAs
Nature (2018)553: 82–85
doi:10.1038/nature25027
背景
在宿主引起的基因沉默（host-induced gene silencing，HIGS）机制中，siRNA产生的基因沉默靶向病原体和寄生物的mRNA。植物中的HIGS对于真菌、线虫、昆虫和寄生植物菟丝子十分有效。HIGS机制表明植物与寄生物之间存在自然的小RNA交换。与这个假设一致的是，来自植物病原菌灰霉菌（Botrytis cinerea）的小RNA在侵染的过程中靶向宿主mRNA，并且为了减少病原体的毒力HIGS靶向灰霉菌中的dicer-like的mRNA。相反地，棉花中的miRNA可以进入到真菌病原体（Verticillium dahliae）中。然而，植物与植物之间的miRNA的自然交流还没有报导。
菟丝子（Cuscuta campestris）的吸器能够便于病毒、蛋白和mRNA的双向移动，但是这些移动的具体功能还未知。菟丝子易受HIGS的影响，因此假设通过菟丝子的吸器小RNA可以与受体物种间进行交换，并且影响受体物种的基因表达。
主要材料方法
1. 材料与数据
利用寄生在拟南芥上的菟丝子进行小RNA高通量测序，共收集三种不同类型的组织，每种组织有两个生物学重复。三种不同类型的组织分别如下：寄生茎，包括菟丝子吸器上不的茎；交界面，包括菟丝子的吸器和茎，以及拟南芥的茎；宿主茎，包括拟南芥在交界面上部的茎。
小RNA数据已上传到NCBI GEO, 编号为GSE84955， 项目编号为PRJNA408115.
2. 主要分析流程
生物信息学分析：所有数据都在拟南芥和菟丝子中鉴定小RNA，并且进行差异表达分析, 鉴定和分析涉及的主要软件有targetfinder.pl 和GSTAr.pl (小RNA靶向预测)、shortStack（小RNA测序分析）、strucVis（小RNA二级结构可视化）。
主要结果
1、菟丝子miRNA在吸器与拟南芥的交界面被诱导产生
与寄生茎相比，交界处的寄生物的RNA与宿主的RNA相互稀释，因此菟丝子小RNA位点的表达量在交界处都下调（图1a）。然而，有76种菟丝子小RNA在交界处显著上调（FDR≤0.05），其中43种（57％）miRNA在前体的发夹结构中具有离散的miRNA对中出现积累（图1b）。同时来自RNA印迹的证据说明特定miRNA在交界面的特异性表达（图1c）。 43种miRNA其中的一种是保守MIR164的一员， 其他42种上调的miRNA和已知miRNA序列相似性很低。在发芽四天并和寄主互作菟丝子材料中，通过PCR检测到了了几个miRNA。
图1 菟丝子miRNA在吸器与拟南芥的交界面被诱导产生
2、菟丝子miRNA引起基因沉默和宿主mRNA产生siRNA
大多数菟丝子诱导的miRNA产生了22nt的成熟miRNA。这种22nt的miRNA在植物中发生频率低于21个nt的miRNA，并且与次级siRNA密切相关,而次级siRNA被认为会扩大miRNA指向基因沉默。假设诱导产生的22nt的miRNA会导致形成次级siRNA。因此，在拟南芥miRNA测序数据中进行搜索包含miRNA互补位点并具有在界面处特异性积累siRNA的序列，共发现六个拟南芥mRNA符合：TIR1，AFB2和AFB3，编码生长素受体，BIK1，编码一种质膜定位所需的激酶， SEOR1，编码韧皮部蛋白和HSFB4，它编码预测的转录抑制因子。由这些mRNA产生的siRNA和其他实例的次级siRNA在大小分布，双链积累和定相中的作用相似（图2a，b）。 其中TIR1，AFB2和AFB3三个mRNA已知被22nt的miR393所靶向并在下游产生二级siRNA。而在寄生茎中，TIR1，AFB2和AFB3三个mRNA所产生的次级siRNA向上游移位，靠近和菟丝子miRNA互补的位点，暗示菟丝子产生的miRNA和miR393不相关，并触发了和宿主交互界面的次级siRNA。对未加帽的mRNA片段的分析显示在与菟丝子miRNA互补的所有位点均有定向切割的现象，特别是来自交互界面的样品，同时在对照样品中的miRNA没有这个现象（图2）。
图2 菟丝子miRNA引起基因沉默和宿主mRNA产生siRNA。
3、菟丝子miRNA和它们的靶基因的效应
在拟南芥转录数据中，没有找到任何靶向这六个拟南芥mRNA的拟南芥miRNA或siRNAs，也没有发现任何内源性菟丝子次级siRNA对应于任何诱导产生的miRNA。这些观察结果表明诱导产生的菟丝子miRNA避免靶向自身转录本，来自菟丝子的22nt的miRNA通过跨物种方式靶向拟南芥mRNA。这六个拟南芥mRNA中的五个相对于一般茎在寄生交界的茎中出现了显著的表达降低（图3a，蓝色为对照样本）。拟南芥中的次级siRNA的表达量积累部分依赖于内源基因DCL4同时完全依赖于RDR6(SGS2)。TIR1基因的次级siRNA表达量在sgs2-1突变体中表达量完全消失而在dcl4-2t中下降（图3b），因此DCL4和RDR6对于次级siRNA十分作用,说明菟丝子诱导的miRNA在宿主细胞中活跃并激发了宿主中的沉默机制从而产生次级siRNA。在scz2, tir1-1/afb2-3等突变体作为宿主时，并未观察到明显菟丝子的生物量变化， 而在bik1突变体作为宿主时，菟丝子生物量发现显著下调（P<0.5）(图3c)。但是由于BIK1同时参与到植物发育和免疫中，其发育相关的功能可能会掩盖其在和菟丝子相互作用中发挥的作用。而在seor1 或afb3-4突变体中观察到菟丝子生物量显著升高（P <0.05）（图3c）。 因此，SEOR1和AFB3都有限制菟丝子在拟南芥上的生长。这种观察与此前SEOR1和AFB3跨物种进行miRNA调控的假设一致。
图3 菟丝子miRNA和它们靶基因之间的效应
4、菟丝子miRNA在宿主中的靶基因的保守性
菟丝子在双子叶植物中有广泛的宿主范围。因此，在双子叶植物中进行了同源基因与菟丝子 miRNA互补的mRNA。其中BIK1，SEOR1，TIR1和HSFB4的同源基因被作为候选目标，其中GAPDH仅能靶向一个物种（图4a），所以得出结论BIK1，SEOR1，TIR1和HSFB4这四个基因能够在多个双子叶植物中靶向菟丝子miRNA。同时在本氏烟草中进行了和拟南芥相同的实验和miRNA研究，和菟丝子接触引发的miRNA位点在两个物种间具有高度可重复性。几种在本氏烟草中诱导产生饿菟丝子miRNA也通过RNA印迹实验得到证实（图4b）。通过对未加帽RNA末端的分析，说明了本氏烟草中miRNA对TIR1同源物的切割（图4c，d）。这直接说明了相同的菟丝子 miRNA靶向不同物种中的同源宿主mRNA。同时在死竹子作为宿主进行菟丝子寄生的实验说明活的宿主是菟丝子寄生产生的miRNA表达的必要条件（图4b）。
图4 菟丝子miRNA在宿主中的靶基因的保守性
小结
菟丝子（Cuscuta spp.）是一种专门寄生的植物，它通过吸器从宿主植物的茎中吸收水分和养分。菟丝子的吸器促进了宿主和寄生物之间的病毒、蛋白、mRNA的双向移动，但是这些双向移动的功能效果目前还未知。本次研究揭示了菟丝子（Cuscuta campestris）在寄生到拟南芥上后，其吸器中积累了大量的新的miRNA，并且大多数这种miRNA是22nt。在植物中22nt长的miRNA并不常见，并且可能与次级siRNA（siRNA）产生与靶沉默的扩增相关。在寄生状态，有些22nt的菟丝子miRNA靶向拟南芥的mRNA，从而导致mRNA分裂、二级siRNA产生和mRNA积累量的下降。宿主中编码靶向mRNA的两个位点的突变支持菟丝子显著更高的生长。菟丝子寄生到拟南芥上时表达和活跃的miRNA，也在菟丝子寄生到本氏烟（Nicotiana benthamiana）时表达和活跃。多个其他植物物种中靶mRNA的同源基因也含有能够诱导菟丝子miRNA的预测靶向位点。这些数据揭示菟丝子miRNA能够调节宿主基因的表达，并且表明它们可能在寄生时作为毒力因素。
